Чтобы различить вирусы (иногда размером менее 10 ммк), вирусологам пришлось много поработать. Аппаратура сама по себе не спасла положение. Помогли методы контрастирования: оттенение тяжелыми металлами, избирательное окрашивание солями тяжелых металлов и др. Уже из названия методов ясно, что речь идет о взаимодействии исследуемых биологических объектов с атомами и молекулами тяжелых металлов, а также углерода. Так, при оттенении вирусов на препарат напыляют тончайший слой платины, золота, вольфрама, хрома. Метод позитивного контрастирования основан на том, что соли тяжелых металлов по-разному, выборочно реагируют с различными биологическими веществами. Соли свинца соединяются с белковыми компонентами клеток и тканей, осмий — с липидными веществами и т. п. В результате такой «окраски» структуры приобретают особую контрастность. В основе метода негативного контрастирования лежит другой принцип. Для контрастирования выбирают также вещества с солями тяжелых металлов, но не реагирующие с исследуемым биологическим объектом. Контрастирующее вещество высокой плотности наносят на подложку вместе с вирусом. Теперь вирус в микроскоп виден на темном плотном фоне. Приготовленные тем или иным методом вирусные препараты в конце концов попадают в электронный микроскоп. И здесь мы можем определить их размеры. Сделать это теперь сравнительно легко, необходимо только правильно выбрать масштаб увеличения.
Разведение и титрование вирусного препарата на растениях.
Мы не будем измерять вирусные частицы, а воспользуемся сравнением их с известными предметами, приведенными в книге известного американского вирусолога и биохимика У. М. Стэнли: «Хотя вирусная частица — настоящий гигант среди химических молекул, все же, чтобы заполнить такими частицами мячик для пинг-понга, потребовалось бы 1000000000000000000 частиц вируса полиомиелита ».
Клетка человеческого организма, куда внедряется и которую разрушает вирус, является как бы домом для незваного гостя. Причем домом не маленьким. Например, вирус полиомиелита так же мал по сравнению с клеткой, как человек по отношению к 30-этажному зданию.
Титрование. В практике вирусологии большое значение имеет активность вирусов. Для того чтобы исследовать, например, активность вируса табачной мозаики, из листьев пораженного растения отжимают сок. В этом соке (его называют нативным) вместе с частицами разрушенных клеток плавают и вирусы.
Если ввести такой сок (или экстракт из ткани пораженного организма) в организм мышей, в куриный эмбрион или в клетки определенного растения- индикатора, то через некоторое время появляются следы поражения.
При титровании сок (или экстракт) последовательно разводят дистиллированной водой или буферными растворами, с каждым действием уменьшая концентрацию нативного сока (а следовательно, и концентрацию вирусов) в десять, сто, тысячу раз. Этими «разведениями» заражают отдельный индикатор (растение, эмбрион и т. п.). На клетки индикаторов набрасываются тысячи или единицы вирусов (это зависит от «разведений») и приступают к своей разрушительной работе. И хотя вирусы не были видны, но результаты их работы вскоре становятся очевидными.
Чем больше активность вирусов, чем выше концентрация, тем скорее и больше появится пораженных клеток. Количество очагов (бляшек) можно сосчитать, площадь и время их появления можно замерить, значит, можно рассчитать скорость, плотность и т. д. Появляется возможность количественной обработки результатов исследования, без которой не могут обходиться естествоиспытатели.